替米考星检测试剂盒使用说明书
（酶联免疫法）
1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，检测组织、肝脏、蜂蜜、鸡蛋和牛奶中的替米考星含量。试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的替米考星和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗替米考星抗体，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其替米考星含量成负相关，与标准曲线比较乘以样本稀释倍数即可得出样本中替米考星的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃，30min～15min
2.3 检测下限：
动物组织（高检测限） ……… 0.5ppb
动物组织（低检测限） ……… 10ppb
肝脏（鸡肝、 猪肝）………… 10ppb
蜂蜜…………………………… 1ppb
鸡蛋、牛奶…………………… 5ppb
2.4 交叉反应率：
替米考星 ………………………100%
泰乐菌素………………………… 1%
2.5 样本回收率：
动物组织（高检测限）……… 90%±20%
动物组织（低检测限）……… 90%±20%
肝脏（鸡肝、鸭肝、猪肝）… 75%±15%
蜂蜜…………………………… 95%±25%
鸡蛋、牛奶…………………… 95%±25%
3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准液：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高标准液：1ppm
酶标记物（红盖）……………………5.5ml
抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
2×复溶液（黄盖） …………………50ml
20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
说明书…………………………………1份
盖板膜…………………………………1张
自封袋…………………………………1个
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、振荡器、氮气吹干装置、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl
4.3 试剂：无水碳酸钠（分析纯）；碳酸氢钠（分析纯）； 甲醇（分析纯） ；乙酸乙酯（分析纯）；去离子水；正已烷
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液 1: 0.1M (PH=10.6) CB 缓冲液
称取 0.932g 无水碳酸钠和 0.1g 碳酸氢钠加入 100ml 去离子水溶解混匀。
配液 2: 0.5M (PH=10.6) CB 缓冲液
称取 4.66g 无水碳酸钠和 0.5g 碳酸氢钠加入 100ml 去离子水溶解混匀。
配液 3:复溶液
1 份 2× 复溶液 +1 份去离子水混匀，即可得到复溶液。
配液 4: 牛奶、鸡蛋稀释液
取复溶液与甲醇按 19:1 体积比混合，即（ 19 份复溶液 +1 份甲醇）。
配液 5: 洗涤工作液
用去离子水将 20× 浓缩洗涤液按 1 ： 19 体积比进行
稀释（ 1 份 20× 浓缩洗涤液 +19 份去离子水）用于酶标板的洗涤， 洗涤工作液在 4 ℃（ 39.2 ℉）环境可保存一个月 。
5.3.1高检测限样本前处理方法
动物组织（猪肉、 鸡肉、 牛肉、 羊肉、 鱼、 虾）
1、称取 2.0 ± 0.05g 均质后的组织样本至 50ml 聚苯乙烯
离心管中，分别加入 2ml 0.1M （ PH=10.6 ） CB( 配液 1)
和 8ml 乙酸乙酯，用涡动仪涡动 3min ，3000r/min
室温离心 5min ；
2、取 4ml 上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃管中，于
50-60 ℃水浴氮气流下吹干；
3、 加入 1ml 正已烷，用涡旋仪涡动 30s ，再加入 1ml
复溶液， 用涡旋仪涡动 30s ， 3000 r/min 室温离心
5min ；
4、除去上层，取下层 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.5ppb
5.3.2低检测限样本前处理方法
动物组织（猪肉、 鸡肉、 牛肉、 羊肉、 鱼、 虾）
1、 称取 1.0 ± 0.05g 均质后的样本至 50ml 聚苯乙烯离心
管中，加入 4ml 洗涤工作液（配液 5 ），用涡动仪
涡动 3min ， 3000 r/min室温离心 5min ；
2、 取 200μl 上层清液，再加入 600μl复溶液，用涡旋仪涡动 30s ，混匀；
3、取 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：20 检测下限：10ppb
5.3.3 肝脏（鸡肝、鸭肝、猪肝）
1、称取 1.0 ± 0.05g 均质后的样本至 50ml 聚苯乙烯离心管中， 分别加入 2ml 0.5M （ PH=10.6 ） CB( 配液 2) 和8ml 乙酸乙酯，用涡动仪涡动 3min ，3000 r/min 室温离心 5min ；
2、取 2ml上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃管中，于50-60 ℃水浴氮气流下吹干；
3、加入 1ml 正已烷，用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶液，用涡旋仪涡动 30s，3000 r/min 室温离心5min；
4、 除去上层，取 100μl下层加 400μl复溶液，用涡旋仪涡动 30s，混匀；
5、取 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：20 检测下限：10ppb
5.3.4蜂蜜
1、称取 2.0 ± 0.05g 蜂蜜样本至 50ml 聚苯乙烯离心管中， 分别加入 2ml 0.1M （ PH=10.6 ） CB( 配液1），和 8ml乙酸乙酯，用涡动仪涡动 3min ， 3000g 室温离心 5min ；
2、取 2ml 上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃管中，于 50-60 ℃水浴氮气流下吹干；
3、加入 1ml复溶液 ，用涡旋仪涡动 30s ，混匀；
4、取 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：2 检测下限：1ppb
5.3.5、鸡蛋
1、用均质器低速均质鸡蛋样本；
2、取 100μl 均质后的鸡蛋样本加 900μl 鸡蛋稀释液 ( 配液 4) ，用涡旋仪涡动 30s ，混匀；
3、取 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：10 检测下限：5ppb
5.3.6 牛奶
1、取 100μl 鲜牛奶样本；
2、加入 900μl 牛奶稀释液 ( 配液 4) ，用涡旋仪涡动 30s ，混匀；
3、取 50μl 用于分析。
样本稀释倍数：10 检测下限：5ppb
6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μl/孔，再加入50μl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。
6.3 洗 涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 显 色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。
6.5 终 止：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
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百分吸光度值（%）＝ |
A |
×100% |
|
A0 |
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。